VIH-proviral : le ciseau génétique se prépare à couper

5. avril 2016
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Malgré les progrès, il est actuellement impossible de guérir le VIH. Bien que les médicaments inhibent la multiplication du virus, il n’est pas encore possible d’accéder au matériel génétique du VIH intégré dans le génome des cellules hôtes. Une enzyme nouvellement développée arrive à découper le provirus de la cellule hôte.

Le virus VIH est un virus à ARN qui appartient au groupe des lentivirus de la famille des retrovirus. Après la pénétration dans le flux sanguin, il se lie à des récepteurs CD4 des diverses cellules sanguines telles que les lymphocytes T CD4 + ou les macrophages. Ensuite, le virus fusionne avec la cellule et libère la capside dans le cytosol. Au cours de l’étape suivante, l’ARN viral est libéré de la capside, transcrit en utilisant une transcriptase inverse en une molécule d’ADN circulaire qui peut éventuellement être incorporée dans le génome de la cellule hôte. Dans cette phase, le virus VIH est également appelé un provirus. Bien protégé contre l’attaque d’agents antiviraux, il peut survivre pendant plusieurs années jusqu’à ce que la prochaine phase de l’infection, la production de composants viraux, commence.

La recombinase développée est efficace et précise

Une équipe dirigée par Frank Buchholz de la TU Dresden et Joachim Hauber de l’Institut Heinrich Pette à Hambourg [Paywall] a récemment eu l’idée de produire une enzyme qui détecte et supprime le provirus dans le génome de la cellule hôte. Toutefois, afin de distinguer l’ADN viral de l’ADN de la cellule hôte, il fallait un « ciseau génétique » pour une séquence de reconnaissance, une séquence spécifique de nucléotides dans la molécule d’ADN du virus. Pour cela, l’équipe a examiné les longues répétitions terminales (LTR), qui sont situées aux deux extrémités du provirus. Il s’agit d’une séquence d’ADN constituée de paires de bases répétitives longues de plusieurs centaines de nucléotides. Au sein de la LTR, les chercheurs ont découvert une séquence de 34 paires de bases, qui se retrouve de manière presque inchangée dans plus de 80 pour cent de tous les virus du VIH, et l’ont appelé loxBTR.

Dans la phase suivante, à partir de la séquence loxBTR, la structure de l’enzyme a été progressivement ajustée au moyen d’une évolution dirigée et ainsi une recombinase appelée Broad-Range Recombinase 1, en abrégé Brec1, a été générée. Pour le développement, les scientifiques eurent besoin en tout de 145 étapes, une étape durant deux à trois jours, ce qui signifie un temps total de développement d’environ un à deux ans. Dans des essais ultérieurs sur les bactéries E. coli, la recombinase développée a été testée pour son efficacité et sa spécificité. Par exemple Brec1 ne reconnut pas la séquence d’ADN de 34 paires de base appelé loxP, même si elle présente une homologie de séquence de 32 pour cent à loxBTR. Dans le monde entier, de plus en plus de virus ayant des mutations de la séquence de reconnaissance sont découverts. Pour s’assurer que ceux-ci soient reconnus par le « ciseau génétique», les scientifiques ont créé quatre loxBTR avec une mutation ponctuelle qui peut devenir réelle. Le résultat : Brec1 a également reconnu ces régions.

De la bactérie aux cellules de mammifères

Des résultats similaires ont été obtenus par les scientifiques dans des expériences avec des cellules de mammifères (cellules HeLa), dans lesquelles le génome du VIH-1 a été intégré de manière stable. Encore une fois, Brec1 reconnaît efficacement et spécifiquement la cible loxBTR. Puis Brec1 a été testé sur des lymphocytes T humains PM1 qui avaient été infectés par des virus compétents pour la réplication. Cette lignée de cellules T est couramment utilisée dans la recherche pour le VIH-1. Alors que dans le groupe témoin, une augmentation de la charge virale a été observée, les cellules positives à Brec1 ne relâchèrent aucune particule virale.

L’équipe de scientifiques utilisa des cellules T CD4 + isolées du sang des patients atteints du VIH pour des études complémentaires. Après transduction avec un vecteur lentivirus Brec1-positif, les cellules ont été cultivées pendant 20 jours. Alors que dans le groupe témoin la charge virale a augmenté et le nombre de cellules traitées a diminué, la quantité de cellules CD4 + Brec1-positif est restée constant et le nombre de particules virales libérées a diminué. Selon les auteurs, cela serait une indication selon laquelle la recombinase a enlevé le provirus du génome. Le séquençage de l’ADN (Deep Sequencing) consécutif a confirmé l’hypothèse. 20 jours après la transduction, les scientifiques ne purent trouver aucun ADN proviral dans la séquence de la molécule d’ADN.

De la cellule de mammifère à la souris

Ensuite, l’équipe de recherche a administré à des souris le matériel Brec1-positif des patients. Au bout de 18 à 21 jours, la charge virale était tombée dans le plasma des animaux sous la limite de détection (<20 VIH-1 copie d’ARN / ml). Cependant, étant donné que les cellules T ont une durée de vie limitée, l’équipe de recherche a, au cours de l’étape suivante, inséré Brec1 dans des cellules souches du sang humain puis les a injectées à des souris récemment nées. Comme toutes les cellules sanguines qui ont été formées à partir des cellules souches Brec1-positives expriment également la recombinase, les souris Brec1, contrairement au groupe de contrôle, présentaient à peine une charge en VIH.

Aucun effet indésirable

Par la suite, Brec1 a été testé pour la cytotoxicité, l’effet cytopathique et les effets génotoxiques. A cet effet, la recombinase a été transférée entre autres dans des lymphocytes T CD4 + humains et ils ont ensuite été examinés pour l’expression de gènes, l’apoptose et l’activité ainsi que la fonction immunitaire. Il n’y avait pas de différences significatives entre les cellules témoins et Brec1. Pour la détection de la génotoxicité, les scientifiques ont déterminé les six génomes dont la séquence ADN a le plus de similitudes avec celui de loxBTR. Ils les testèrent dans la bactérie E. Coli.

Du fait qu’aucune de ces suites nucléotidiques ne fut recombinée, les auteurs ont conclu que le génome humain ne contient manifestement pas de séquence d’ADN similaire à loxBTR qui serait reconnue par Brec1. Enfin, l’équipe de scientifiques a génétiquement modifié des souris de telle sorte que celles-ci expriment Brec1 avec un promoteur constitutif. Ces animaux sont restés en bonne santé durant une période de 18 mois.

D’autres méthodes d’édition génétique

Ce procédé qui découpe le matériel génétique viral du génome de la cellule hôte n’est pas entièrement nouveau. Déjà en 2013, les scientifiques autour de Frank Buchholz et Joachim Hauber montrèrent l’effet antiviral de la recombinase Tre dans les modèles de souris humanisées. L’enzyme avait été créée précédemment par les chercheurs. Cependant, la séquence cible dans les différentes classes de VIH-1 n’était pas suffisamment conservée de telle sorte que moins d’un pour cent des patients infectés par le VIH pourrait bénéficier de la thérapie.

D’autres approches d’édition génique sont les méthodes CRISPR-Cas9, la méthode des nucléases à doigt de zinc et le processus TALEN. Les CRISPR sont des sections d’ADN répétitives dans le génome des bactéries, par exemple. Ils appartiennent à un mécanisme qui permet aux bactéries de rendre l’ADN étranger inoffensif. Le système CRISPR / Cas9 [Paywall] génère des cassures double brin dans l’ADN cible, où les séquences d’ADN peuvent être enlevées ou de nouvelles insérées. Les nucléases à doigt de zinc sont produites artificiellement. Elles contiennent un certain domaine protéique avec un ion zinc lié coordinatif. Ces domaines à doigt de zinc se lient à une séquence spécifique d’ADN, qui sont coupées par les nucléases. Par la suite, l’ADN étranger peut être intégré. Les Transcription activator-like effector nucleases (Talen) sont des protéines de fusion composées d’une endonucléase qui coupe l’ADN et un domaine de liaison à l’ADN.

L’utilisation d’une recombinase a, selon les auteurs, l’avantage de ne pas générer de cassures double-brin, qui activeraient les mécanismes de réparation en comparaison à d’autres méthodes d’édition génétique selon les auteurs dans leur étude. Cela ne peut pas créer des réarrangements prévisibles de la séquence d’ADN. Les recombinases, en contraste, réparent l’ADN elles-mêmes après la découpe. Cependant, l’inconvénient de Brec1 par rapport aux nucléases est que sa fabrication est très fastidieuse.

L’ère de la chirurgie du génome

Avec 37 millions de personnes infectées et plus de 2 millions de nouvelles infections par an, le VIH continue d’être un défi majeur pour le monde de la santé. En Allemagne, actuellement environ 83 000 personnes vivent avec le virus du VIH. Environ 72 pour cent des personnes touchées sont infectées par le VIH-1 du groupe M sous-types A, B ou C. Parmi ces virus VIH, 90 pour cent ont la séquence exacte loxBTR. Cependant la séquence loxBTR est aussi présente dans la plupart des autres virus VIH (éventuellement légèrement modifiée), les auteurs supposent que plus de 28 millions de personnes pourraient être concernés par la thérapie.

« Cette tendance [générer des scalpels moléculaires] sera bénéfique non seulement aux patients VIH, mais aussi à de nombreux autres patients ayant des maladies liées à la génétique. Nous sommes sur le point d’inaugurer l’ère de la chirurgie génomique », prédit le Prof. Frank Buchholz, euphorique. Cependant, les scientifiques considèrent dans leur étude qu’avant un usage humain, les avantages des technologies d’édition génétique doivent être comparés aux risques potentiels. De plus, il est tout à fait possible qu’une seule méthode ne soit pas suffisante pour guérir toutes les personnes du VIH.

Les auteurs suggèrent que les futures stratégies de traitement du VIH combinent plusieurs approches antivirales. Un exemple serait des médicaments qui activent des virus latents, des immunomodulateurs et des thérapies géniques. Mais d’ici à ce que cela arrive, il se passera très probablement quelques années. La prochaine étape serait des essais chez les patients VIH. Il faut encore attendre de voir si la méthode se confirme dans ce cadre. Certains des auteurs ont déjà déposé un brevet sur Brec1 et ne devraient donc pas, si la méthode devait être couronnée de succès, repartir les mains vides.

Publication originale :

Directed evolution of a recombinase that excises the provirus of most HIV-1 primary isolates with high specificity
Karpinski et al.; Nature Biotechnology, doi: 10.1038/nbt.3467; 2016

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