Analyser les traces dans le génome

24. avril 2008
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De nouvelles méthodes d'analyse ADN pourront bientôt accroître les chances de réussite dans le laboratoire de microbiologie. Car des automates de pyroséquençage dépistent des agents jusqu'à présent inconnus en peu de temps, temps qui peut être crucial pour sauver la vie d'un patient.

Beaucoup d’autres méthodes avaient échouées dans ce cas. Les médecins du laboratoire n’arrivaient pas identifier l’agent responsable, aussi bien avec les méthodes classiques de la microbiologie qu’avec ACP ou autres méthodes établies de la technologie ADN. Le prétendu meurtrier de 3 bénéficiaires de transplantations d’organes se laissa finalement démasquer grâce à une nouvelle technique de séquençage d’ADN. Le « pyroséquençage » automatisé permit aux scientifiques de l’université Columbia de New-York ainsi qu’à leurs collègues du laboratoire « Infectious Diseases Reference Laboratory » à Victoria en Australie de déterminer qu’une souche d’arénavirus jusqu’à présent inconnue était responsable d’une encéphalite mortelle.

100 000 brins d’ADN séquencés en même temps

Chez les humains, les infections avec un arénavirus évoluent normalement de manière asymptomatique ou se manifestent par des symptômes similaires à ceux d’une petite grippe s’ils sont transmis par des rongeurs. Les membres connus de cette famille sont le virus de la chorioméningite lymphocytaire et l’agent beaucoup plus dangereux de la fièvre de Lassa. « Le donneur d’organe ne montrait aucun signe d’une affection aiguë », décrit Gustavo Palacios et son collègue dans le « New England Journal of Medicine« . Les trois femmes australiennes, qui avaient reçu les reins et le foie du donneur mort d’une hémorragie cérébrale, décédèrent à leur tour en l’espace de 4 à 6 semaines Cette mauvaise nouvelle ne laissa pas les microbiologistes australiens en paix. Ils s’adressèrent à Ian Lipkin, Professeur d’épidémiologie, de neurologie et de pathologie à l’université Columbia de New York.

Grâce à la technique ACP, son équipe pût séquencer environ 100 000 brins d’ADN provenant d’isolats d’ARN des reins, du foie et du liquide céphalo-rachidien de 2 des bénéficiaires. L’ordinateur fit le reste : il réduisit le nombre des données en les comparant avec les données connues du génome humain, les données restantes pouvant constituer les brins d’un agent microbien. La traduction en séquences d’acides aminés donna alors un indice déterminant : la séquence des blocs de protéines ressemblait à celle du virus de la chorioméningite lymphocytaire. On trouva effectivement un arénavirus d’un nouveau genre dans 22 des 30 échantillons de séquences d’ARN. En le sachant, les microbiologistes réussirent aussi à détecter sérologiquement le matériel du virus provenant des échantillons dans la culture de cellules.

Pour les bactéries, les virus et … les Néandertaliens

Richard Whitley, Professeur de microbiologie à l’université d’Alabama, fait l’éloge de la nouvelle méthode de séquençage dans un commentaire sur l’article : « elle est idéale pour la pratique avec des bactéries, des champignons, des parasites ou des virus inconnus ». Car le pyroséquençage automatisé permet d’analyser très vite de nombreuses séquences courtes d’ADN, autrement qu’avec l’ACP ou les méthodes utilisées jusqu’à présent. Comme pour les 2 techniques classiques de séquençage, un détecteur enregistre l’incorporation des différents nucléotides. Lors de la réaction, le pyrophosphate est libéré et se laisse transformer enzymatiquement en signal lumineux. La société 454 Life Sciences appartenant au groupe Roche automatisa finalement la technique pour le « High throughput Sequencing » avec une production de données de 100 millions de nucléotides en 7 heures.

Cette méthode est cependant contestée dans l’analyse de séquences du génome plus longues comme par exemple chez l’homme car elle se trouve ralentie sur des bouts d’ADN plus longs que 150-200 paires de base. Mais pas lorsqu’il s’agit d’échantillons vieux de 40 000 années. Car Svante Pääbo et ses collègues de l’institut Max-Planck d’anthropologie évolutionnaire à Leipzig purent jusqu’à présent décoder plus d’un million de paires de base du génome de nos ancêtres à partir de petits bouts d’ADN d’os de Néandertaliens et ont ainsi rendu célèbre cette technique à travers le monde. Le but du projet est de décoder complètement le génome et de le comparer à celui de l’Homo sapiens actuel. La méthode convient particulièrement bien pour des séquences d’ADN courtes mais aussi pour l’analyse d’ADN de microbes.

En cas d’encéphalite, la recherche d’un agent reste sans succès dans 1 cas sur 10 dans les laboratoires américains. Dans le cas d’infections des voies respiratoires chez les enfants, les médecins ont du succès dans seulement 30 à 60% des cas, nous dit Whitley dans son article. « La détermination précise et rapide d’agents pathogènes prend de plus en plus d’importance dans le cadre de la globalisation mondiale – notamment quand le traitement, le contrôle de la progression d’une épidémie ou comme ici la sécurité de transplantations d’organes en dépend », nous dit Ian Lipkin au sujet de l’importance de la méthode. La technique semble déjà être au point pour pouvoir également caractériser rapidement des agents inconnus jusqu’à présent. Elle ne fait cependant pas encore partie du répertoire de la médecine de laboratoire. « Pas encore », nous dit Andreas Nitsche de l’institut Robert Koch car il existe trop peu de ces appareils en Allemagne – la plupart étant destinés à d’autres usages. J’espère que cela va prochainement changer. »

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