Lichtblattmikroskop: Der Objektträger dankt ab

18. Januar 2013
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Das Zusammenspiel der Immunzellen beim Kampf gegen Eindringlinge und Gewebe am Stück in 3D betrachten - bisher nur in Computeranimation oder Schnitt möglich. Ein Mikroskop soll bei biomedizinischer Forschung und klinischer Diagnostik Abhilfe schaffen.

Das Konzept für ein derartiges Mikroskop ist alles andere als neu. Es wurde bereits im Jahr 1902 von dem Physiker Henry Siedentopf und dem österreichischen Chemiker Richard Zsigmondy publiziert und beruht auf der sogenannten Spaltlichtbeleuchtung. Das bedeutet, dass sich der Lichtstrahl im 90-Grad-Winkel zum Auge befindet. “Jeder kennt dieses Phänomen, wenn das Licht am Nachmittag seitlich in ein Zimmer fällt. Dann sieht man plötzlich die feinsten Staubpartikel durch die Luft fliegen”, veranschaulicht Dr. Andreas Beilhack den Tyndall-Effekt, der beispielsweise in optischen Rauchmeldern und in speziellen Lampen von Augenärzten zum Einsatz kommt.

Siedentopfs und Zsigmondys Ultramikroskop ließ durch eine seitliche Spaltlichtbeleuchtung kleinste Partikel unter der Auflösungsgrenze des Lichts erkennen; also Teilchen, die kleiner als ein 20.000stel Millimeter sind. Zsigmondys bahnbrechende Beobachtungen, die mit Hilfe dieses Mikroskops gelangen, wurden 1925 mit dem Nobelpreis für Chemie geehrt.

Selbstgebasteltes Hochleistungsmikroskop

Mehr als 100 Jahre später haben nun Würzburger Wissenschaftler diese Technik mit Hilfe moderner Laser- und Computertechnologie verfeinert. Innerhalb von wenigen Minuten können die Wissenschaftler mit dem selbstgebauten Mikroskop Körpergewebe in tausenden optischen Schnittbildern abscannen und über einen Hochleistungsrechner in drei Dimensionen wieder zusammensetzen. “Unser Ansatz beruht auf modernster Lasertechnologie, neuartigen Fluoreszenzfarbstoffen und Hochleistungsrechnern, die in Kombination phantastische Möglichkeiten für die biomedizinische Forschung und in Zukunft für die klinische Diagnostik eröffnen”, so Beilhack. Damit sei es beispielsweise möglich, die Wechselwirkung von Immunzellen mit Krebszellen oder das Geschehen bei Abstoßungsreaktionen nach einer Transplantation sichtbar zu machen.

“So lernen wir anschaulich, die vielseitigen Funktionen unseres Immunsystems zu verstehen”, so Andreas Beilhack, Leiter einer Forschergruppe des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF Würzburg) an der Medizinischen Klinik und Poliklinik II und der Universitäts-Kinderklinik.

Auf den Brechungsindex kommt es an

Die spezielle Technik, die tief im Gewebe intakter Mausorgane oder in Biopsien von Krebspatienten Zellen und Moleküle mittels Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar macht, hat Christian Brede entwickelt, Doktorand in der Forschergruppe von Andreas Beilhack. Dazu werden gewebespezifische Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert. So lassen sich verschiedene Zellen in unterschiedlichen Farben markieren. “Die größte Herausforderung dabei war, das Gewebe homogen zu färben, also die fluoreszenzmarkierten Antikörper durch das verdichtete Tumorstroma tief ins Gewebe zu bringen”, erklärt Beilhack. Dies sei den Forschern nur nach einer intensiven Zeit des Experimentierens und Optimierens gelungen.

Der Clou am Verfahren sind Lösungsmittel, die in das Gewebe eingebracht werden und den gleichen Brechungsindex wie das Körpereiweiß haben. Sie sorgen dafür, dass das Gewebe plötzlich durchsichtig erscheint. “Diesen Effekt kennt man aus der Küche, wenn man einen Tropfen Öl auf ein weißes Papier bringt”, erklärt Brede. Weil Öl und Papier einen ähnlichen Brechungsindex besitzen, wird das Papier transparent. Mit dem aktuellen Mikroskop können die Wissenschaftler bis zu drei Farben gleichzeitig analysieren. “An weiteren Farben, mit denen man noch komplexere Prozesse darstellen kann, wird momentan gebastelt”, so Beilhack.

Lehre, Forschung und Diagnostik

Beilhack sieht drei große Anwendungsgebiete für seine neue Mikroskopietechnik: “Eine dreidimensionale Darstellung der Immunzellen während ihrer Interaktion hilft den Studierenden, die Zusammenhänge der Immunzellen besser zu verstehen.” Auch der biomedizinischen Forschung und der klinischen Diagnostik wird die neue Technik zugutekommen. “Wir können bereits ganze Organe der Maus und große Gewebestücke des Menschen abscannen und bestimmte Zelltypen darin quantifizieren“, so Beilhack. Den Algorithmus der Software dazu haben die Wissenschaftler selbst programmiert.

Bei Gewebeschnitten könnten die gesuchten Zellen in einem Schnitt über- oder unterrepräsentiert sein. “Physische Schnitte beruhen auf dem Zufallsprinzip”, grenzt Beilhack die Vorteile seiner neuen Methode ab. Die mikroskopische Gewebeuntersuchung hingegen liefere sehr verlässliche Ergebnisse. Auch seltene Zelltypen könnten mit der neuen Technik in einem Gewebestück zielsicher aufgespürt werden, was mit der Kryoschnittmethode ein zeitintensiver und aufwendiger Prozess ist.

Praktische Anwendungsmöglichkeiten der neuen Mikroskopietechnik sieht Beilhack beispielsweise bei Tumoroperationen, nach denen sich Chirurgen und Pathologen nicht selten uneinig sind, ob genügend pathogenes Gewebe entfernt wurde. „In dreidimensionaler Darstellung können derartige Beurteilungen zweifelsfrei getroffen werden“, so Beilhack. Dass die neue Mikroskopietechnik die traditionellen histologischen Untersuchungsverfahren gänzlich ablösen wird, glaubt Beilhack zwar nicht, „aber sie wird sie an vielen Stellen ergänzen.“

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Medizin

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6 Kommentare:

Medizinjournalistin

Lieber Herr Dolgner,

es bestehen mittlerweile verschiedene technische Möglichkeiten, wie man lichtmikroskopisch die 1873 von Ernst Abbe beschriebene Auflösungsgrenze unterschreiten kann. Besonders hervorzuheben sind hier die bahnbrechenden Entwicklungen des deutschen Physikers Stefan Hell.

Stichworte zu verschiedenen Lichtmikroskopietechniken mit sehr hoher Auflösung bis zu 2,4 Nanometer: STED-Mikroskopie, 4Pi-Mikroskopie, SSIM, sowie PALM und STORM.

Die Erzielung dieser sehr hohen Auflösung (unter 200 Nanometer) war aber nicht der Fokus der hier vorgestellten Lichtblatt-Mikroskopie, sondern vielmehr die dreidimensionale Darstellung und Quantifizierung von Zellen und ihren komplexen Interaktionen in großen Gewebestücken, ohne dass diese physisch aufgeschnitten werden müssten.

Herzliche Grüße,

Sonja Schmitzer

#6 |
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Medizinjournalistin

Lieber Herr Schmidt,

vielen Dank für Ihr Interesse an diesem Artikel. Für Ihr besseres Verständnis hier noch ein paar Zusatzinformationen:

Der Begriff Lichtblattmikroskopie leitet sich davon ab, dass der Laserstrahl in ein zweidimensionales Lichtblatt aufgefächert wird. Dies ist in der Abbildung dargestellt. Dieses erzeugte Lichtblatt beleuchtet eine Probe in einer gesamten Ebene (X-Y). Wenn man nun im rechten Winkel auf das Objekt (zB humane Gewebebiopsie) blickt, dann sieht man ein zweidimensionales Bild. Bewegt man das Objekt durch dieses Lichtblatt (in der Z-Ebene) kann man ein dreidimensionales Bild erzeugen.

Die Bauweise von einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop unterscheidet sich wesentlich. Ähnlich dem traditionellen Lichtmikroskop bewegt sich der Strahlengang zur Anregung des Objekts nicht im rechten Winkel, sondern parallel zum Auge.

Die von Ihnen erwähnte SIM (Structured illumination microscopy) ist ein Verfahren zur Erhöhung der Auflösung ¿ diese Technik kann sowohl mit der klassischen Laser-Scanning-Mikroskopie, als auch mit der neuen Lichtblattmikroskopie kombiniert werden.

Beides sind großartige Mikroskopieverfahren, ermöglichen jedoch im Gegensatz zur Lichtblattmikroskopie nicht das Mikroskopieren von größeren Gewebevolumen tief im Gewebe, wie sie in der aktuellen Studie gezeigt wurden.

Die wesentlichen Neuerungen in der vorgestellten Arbeit aus der Würzburger Gruppe um Dr. Beilhack sind die Anwendung der Lichtblattmikroskopie auf immunologische Fragestellungen im Bereich der Transplantation und Tumorbiologie. Diese wurden 1. durch eine verbesserte Bauweise des Mikroskops mit mehreren Farben zur Identifizierung verschiedener Zelltypen oder molekularer Vorgänge, 2. durch die Optimierung homogener Färbemethoden von großen Gewebeproben und 3. durch die Lokalisierung und absolute Quantifizierung von definierten Zellpopulationen innerhalb der gesamten Gewebeprobe ermöglicht.

Die vorgestellte Entwicklung aus Würzburg wurde mit einem selbstgebauten Mikroskop im Sinne der freien Forschung erstellt, ohne dass wirtschaftliche Interessen dahinter standen. Die Studie wurde von der Deutschen José Carreras Leukämie-Stiftung, der Deutschen Forschungsgemeinschaft und vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung des Universitätsklinikums Würzburg finanziell unterstützt.

Herzliche Grüße

Sonja Schmitzer

#5 |
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Thomas Schmidt
Thomas Schmidt

Woher stammt der (wenig instruktive) Begriff “Lichtblattmikroskop”?
Es gibt durchaus Autoren, die generieren zu einem bekannten Phänomen ein neues Wort, um eine “Innovation” zu suggerieren. Das vorgestellte Prinzip entspricht einem konfokalen Laser-Scanning mit Immunfluoreszenz-Labelling. Gern nachzulesen unter http://de.wikipedia.org/wiki/Laser-Scanning-Mikroskop
Ein Bezug zur 3D-SIM-Mikroskopie wäre auch nützlich und angebracht gewesen.
http://de.wikipedia.org/wiki/3D-SIM-Mikroskop
Für beide Verfahren existieren bereits kommerzielle Produkte verschiedener Firmen.
Wenn man sich nicht in den Dunstkreis der Schleichwerbung begeben möchte, müsste das eigentlich – wenigstens marginal – erörtert werden, nach meinem Verständnis. Bisher mag ich also nicht so recht erkennen, worin das tatsächlich Neue besteht. – Schade, DocCheck hatte schon originellere Artikel. Die verlinkten spektakulären 3D-Illustrationen können die inhaltlichen Schwächen des Textes nicht retten. :-(

#4 |
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ein schöner Artikel mit sehr lesenswerten Kommentaren – aber: ich bin kein Physiker oder Ing., aber soweit ich das aus dem Studium erinnere, hat nicht das Licht eine Auflösungsgrenze, sondern das Lichtmikroscop, und diese ist eben durch die kleinste Wellenlänge des Lichts limitiert (“unter der Auflösungsgrenze des Lichts erkennen”). Also bitte auch korrekt ausdrücken, zumal jetzt unklar ist, ob das beschriebene neue Verfahren auch Strukturen, die kleiner als die Wellenlänge des Lichts sind, abbilden kann – was eigentlich nicht sein kann.

#3 |
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Man braucht für Lehrzwecke nicht unbedingt Computergrafik.

Diese Technik könnte ein Forschungswerkzeug sein.

Nichts ist faszinierender als das Leben selbst, z.B. lebendes Blut. Seit Jahr und Tag gibt es die Dunkelfeldmikroskopie. Sind die kleinen Flitzer zwischen den Blutzellen die sich aus den Leukos hinein- und herausbewegen Bakterien ? Sind Bakterien an der Grenze der lichtmikrokopischen Sichtbarkeit der Normalzustand ? Woher stammen sie, was treibt sie an ?

#2 |
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Thomas Schmidt
Thomas Schmidt

Liebe Frau Schmitzer,
diese Mikroskoptechnik ist ja recht einleuchtend. Für spezielle Aspekte der Forschung erscheint das recht nett, die Bilder sind zweifellos schön. Man muss sich aber immer den Fragen stellen: Wie schnell geht das, und was kostet das? Lässt sich das Ergebnis auch später durch dritte reproduzieren, auch nach Jahren?
Seit reichlich hundert Jahren verwendet die konventionelle Mikroskopie Schnitte auf Objektträgern mit dem von Anthony Leuwenhoek erfundenen Durchlichtmikroskop – mit der Zeit freilich etwas aufgepeppt. Als gelernter Morphologe tue ich das seit 30 Jahren.
Wenn wir allen Slogans der Industriepromotion geglaubt hätten, gäbe es z.B. nur noch eine virtuelle Mikroskopie am Computer und keine Schnittpräparate mehr, auch keine Archive mit Objektträgern, sondern Serversysteme in der Größe mehrerer Einfamilienhäuser mit einem recht ordentlichen Stromverbrauch, so dass man für für deren Betrieb noch Geld mitbringen muss.
In puncto Wirtschaftlichkeit, Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit hat der “Objektträger” noch lange nicht abgedankt, wie aufwe(ä)ndig stellt sich Herr Beilhack konventionelle Histologie vor im Verhältnis zu dem Verfahren in seiner Publikation? Ganz abgesehen davon, dass wir mit Originalgewebe und dessen Genom agieren und nicht mit einem Abbild. Das Problem der Schnittrandbeurteilung ist im Prinzip schon längst kostengünstig gelöst, vielleicht ist das noch nicht aufgefallen. Die zitierte Sichtweise der diagnostischen Histologie von Herrn Beilhack verrät den Blick eine Theoretikers aus dem Elfenbeinturm und hat mit der Praxis wenig zu tun. Eine Hinterfragung der Argumente Ihres zitierten Gesprächspartners hätte ich mir schon vorstellen können.
Für die neue Technik ergeben sich aber sicher noch Möglichkeiten der sinnvollen Anwendung, ich sehe da vorangig aber die Forschung/Ausbildung und nicht die tägliche Routine. – Man lässt sich ja auch nicht die Petersilie durch Fleurop schicken ;-)

Beste Grüße

#1 |
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